用qPCR方法檢測支原體的關鍵點——樣品制備

qPCR（定量聚合酶鏈反應）方法在檢測細胞樣品中的支原體時具有多個優勢：

高靈敏度和特異性： qPCR能夠檢測極低濃度的核酸，使其對支原體的早期檢測更為敏感。引物的設計可以確保對目標支原體的高度特異性，減少誤報和假陽性的可能性。

快速性： qPCR是一種高效的方法，通常在幾小時內就能完成。這使得可以迅速獲取支原體存在的定量信息，為及時采取措施提供了可能。

定量能力： 與傳統PCR不同，qPCR可以提供關于支原體數量的定量信息，而不僅僅是檢測是否存在。這對于評估感染的程度和追蹤治療效果非常重要。

自動化和高通量： qPCR可以輕松集成到自動化平臺中，實現高通量的樣品處理。這使得可以同時處理大量樣品，提高檢測的效率。

實時監測： qPCR是實時監測反應的技術，能夠在擴增過程中實時測量核酸的累積量。這有助于確定PCR反應何時進入指數增長階段，提高結果的準確性。

低檢測限： qPCR的靈敏度使其能夠檢測非常低濃度的核酸，即使在樣品中支原體數量很少的情況下也能夠可靠地檢測到。

綜合來看，qPCR在檢測細胞樣品中的支原體方面具有高度敏感、定量準確、快速高效等優勢，使其成為支原體研究和臨床檢測中的重要工具。

在進行qPCR檢測前，需要對樣品進行處理。在處理過程中，以下幾個關鍵點需要注意。

一般來說，樣品和標準品不應長時間放置。這可能會損害標準品的恢復。

使用的反應容器也會對樣品DNA提取造成影響，如果沒有使用低結合核酸反應管，DNA最終容易粘在表面。

在提取DNA之前，將200µl樣品基質在70℃下失活10分鐘是很重要的。培養基及其所含的FBS對PCR有抑制作用，無法檢測到標準品。

對于10cfu標準品，通過DNA提取對樣品進行純化，對于NAT(核酸擴增技術)即傳統PCR或qPCR的后續擴增具有重要意義。

體積不能偏離標準推薦量。如果改變了濃度因子，則有可能樣品基質中不包含任何標準品。

如果出現以上幾種可能性，則標準品或樣品沒有被檢測的效果就會被放大。