提早知道所培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)基中是否有細(xì)菌污染的一種方法

培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，要避免細(xì)菌污染。如果存在細(xì)菌污染，則培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯，細(xì)胞大多在24小時(shí)死亡。在以細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)為基礎(chǔ)的生物藥產(chǎn)業(yè)中，也需要進(jìn)行無(wú)菌檢查。傳統(tǒng)無(wú)菌檢查是采用TSA或TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法，一般需要培養(yǎng)14天，觀察是否有菌落生長(zhǎng)或溶液渾濁。

現(xiàn)介紹一種通過(guò)PCR進(jìn)行無(wú)菌檢查的方法，當(dāng)然該方法也是用于研究。即采用德國(guó)MB的細(xì)菌檢測(cè)試劑盒（Onar Bacteria Detection Kit）。它作為PCR試劑盒，針對(duì)的是細(xì)菌高度保守的16S rRNA序列，陽(yáng)性產(chǎn)物片段大小為467 bp，可跑膠后在紫外燈下觀察。另包含一個(gè)內(nèi)控對(duì)照，用于檢測(cè)PCR反應(yīng)是否正常，該內(nèi)控對(duì)照條帶為140 bp。

需要注意的是，樣品在檢測(cè)前，應(yīng)在95 °C做熱滅活 5分鐘，之后每個(gè)PCR反應(yīng)是加5ul。另外，細(xì)胞培養(yǎng)液中應(yīng)不含抗生素，細(xì)胞應(yīng)在不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，因?yàn)榭股貢?huì)使細(xì)菌水平保持在檢測(cè)限以下（2.4×10的3次方/ml）。另外，檢測(cè)時(shí)應(yīng)做復(fù)孔。整個(gè)反應(yīng)體系為25ul。

該試劑盒可檢測(cè)的細(xì)菌包括：假單胞菌，放線(xiàn)菌，大腸埃希氏菌，沙雷氏菌，卟啉單胞菌，梭菌，葡萄球菌，鏈球菌，乳桿菌，微球菌，芽孢桿菌，克雷伯菌，沙門(mén)氏菌，腸球菌，分枝桿菌，軍團(tuán)菌，葡萄球菌，消化鏈球菌。它不檢測(cè)真菌、病毒和真核細(xì)胞DNA。

典型結(jié)果如下：

總之，早期篩查細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是否有細(xì)菌污染，可以及時(shí)采取措施，而PCR方法更為靈敏、快速和穩(wěn)定，可以根據(jù)實(shí)際情況酌情使用。

 圖. 內(nèi)控對(duì)照顯示PCR反應(yīng)正常，樣本中無(wú)PCR抑制成分。460bp左右存在目的條帶，提示存在細(xì)菌污染。